Zimna pokrzywka, niedobór odporności i autoimmunizacja związana z delecjami PLCG2 AD 4

Wpływ związanych z PLAID delecji PLCG2, w tym zwiększonej aktywności fosfolipazy, zmarłej aktywacji komórkowej w temperaturach fizjologicznych i zwiększonej aktywacji komórkowej w temperaturach sub-fizjologicznych. Panel A pokazuje aktywność enzymatyczną mutantów fosfolipazy C?2 (PLC?2). Komórki COS-7 transfekowano DNA kodującym PLCG2 typu dzikiego lub PLCG2 z delecjami C-końcowej domeny 2 homologii Src (cSH2), eksonem 19 (?19) i eksonami 20 do 22 (?20-22) (po lewej stronie). ). Aktywność PLC?2 badano przez kwantyfikację fosforanów [3H] inozytolu generowanych przez odpowiednie enzymy (po prawej). Aktywność podstawową oznaczono ilościowo w komórkach COS-7 transfekowanych samym PLCG2, podczas gdy stan aktywowany przez Rac obejmował kotransfekcję konstruktem ekspresyjnym V2 Rac2. Paski I wskazują SD powyżej i poniżej średniego uwalniania fosforanu inozytolu dla każdego warunku. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów. C2 oznacza wiążącą wapń domenę C2, motyw EF EF, nSH2 N-końcową domenę SH2, domenę homologiczną pekpliny PH, domenę SH3 SH3, domenę homologiczną z rozszczepioną sPH plekstryną, domenę katalityczną X-box X i domenę katalityczną Y-box Y. Panel B pokazuje zawartość cytoplazmatycznej wapnia (mierzoną poprzez barwienie FLUO-4) w komórkach naturalnych zabójców (NK) przed i po sieciowaniu powierzchni-receptor (strzałka wskazuje czas podawania) u dwóch osobników z PLAID i jednym obiektem kontrolnym. Panel C pokazuje degranulację komórek NK po inkubacji z wrażliwymi komórkami docelowymi, jak zmierzono przez ekspresję CD107a na powierzchni komórki jako procent maksymalnej ekspresji CD107a obserwowanej w kontrolnych komórkach NK. Panel D pokazuje wpływ obniżenia temperatury, przy braku stymulacji powierzchniowej, na zawartość wapnia cytosolowego w komórkach B sortowanych od osobnika będącego przypadkiem i osobnikiem kontrolnym, jak zmierzono na mikroskopie konfokalnym. Punkty danych odzwierciedlają średnią średnią intensywność fluorescencji 100 indywidualnie zobrazowanych komórek, a słupki I wskazują błędy standardowe. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów. Jedna gwiazdka wskazuje wartość P od 0,01 do 0,05, dwie gwiazdki oznaczają wartość P od 0,001 do mniej niż 0,01, a trzy gwiazdki oznaczają wartość P mniejszą niż 0,001. Panel E pokazuje degranulację komórek tucznych, na co wskazuje ekspresja powierzchniowa białka błonowego 2 związanego z lizosomem (LAMP2) i mierzona za pomocą cytometrii przepływowej w 37 ° C (czerwony) i 20 ° C (niebieski) w Laboratorium chorób alergicznych 2 (LAD2) ludzkie komórki tuczne transfekowane formami PLCG2 typu dzikiego i usuniętymi. Każda z trzech delecji, które zostały zidentyfikowane w tych rodzinach, obejmowała C-końcową domenę Src-homologia 2 (cSH2) PLC?2 (Figura 3A), która jest autoaminuklea- cyjna i normalnie zapobiega konstytutywnej funkcji enzymatycznej. 21. Transfekcja komórek COS-7 z konstruktami ekspresyjnymi PLCG2 z delecją pełnej domeny cSH2, delecja eksonu 19 (?19) i delecja eksonów 20 do 22 (?20-22) dała ekwiwalentną ekspresję białka PLC?2 (rysunek S9 w Dodatku dodatkowym), ale podwyższona podstawową i aktywowaną Racem aktywność fosfolipazy, w porównaniu z niezmutowanym konstruktem ekspresyjnym PLC?2 (Figura 3A).
Funkcjonalne badania limfocytów
Pomimo uzyskania funkcji enzymatycznej spowodowanej przerwaniem domeny autohamacyjnej, dystalna sygnalizacja i funkcje zależne od PLC?2 zostały zmniejszone u członków rodziny dotkniętej chorobą. Komórki B wykazywały wadliwy przepływ wapnia i fosforylację pozakomórkowej kinazy regulowanej sygnałem (ERK) w odpowiedzi na powierzchniowe sieciowanie IgM (rysunek S10 w dodatkowym dodatku). Transfekcja komórek A20 za pomocą ?19 lub ?20-22 PLCG2 spowodowała obniżoną fosforylację ERK stymulowaną przez ligację receptora komórek B, w porównaniu z nietransfekowanymi lub nieumyjętnymi komórkami transfekowanymi PLCG2, wskazując na dominujący wpływ tych mutacji na sygnalizację receptora komórek B ( Rysunek S11 w Dodatku Uzupełniającym). Ponadto, komórki naturalnych zabójców od dotkniętych pacjentów wykazywały zmniejszony strumień wapnia po sieciowaniu aktywujących receptorów NKG2D i 2B4 (Figura 3B) i zmniejszonej degranulacji po inkubacji z wrażliwymi komórkami docelowymi (Figura 3C). W przeciwieństwie do tego strumień wapniowy komórek T wywołany przez sieciowanie CD3 był normalny (rysunek S12 w Dodatku uzupełniającym).
Wpływ zimnej ekspozycji na zmutowane komórki
Cytozolowe poziomy wapnia w niestymulowanych, oczyszczonych pierwotnych komórkach B od osobników z PLAID stale rosły ze zmniejszającą się temperaturą, ale były niezmienione z chłodzeniem w niezmotowanych komórkach B (Figura 3D). Podobnie, komórki PLAID B stymulowane przez sieciowanie receptora B-komórkowego miały zwiększoną fosforylację ERK w malejących temperaturach w porównaniu z nieumotywowanymi komórkami B (figura S13 w dodatkowym dodatku)
[patrz też: ginekolog Warszawa, psycholog warszawa, gastrolog rzeszów ]
[patrz też: półpasiec objawy zdjęcia, ośrodek psychoterapii warszawa, olx olesno ]