Przeciwciała w surowicy do kanałów wapniowych typu L u pacjentów z stwardnieniem zanikowym bocznym cd

Białka cytoszkieletowe pochodzące z ludzkiego mózgu33 były darem dr. K. Angelidesa. Charakterystyka frakcji białka cytosolowego i cytoszkieletowego wykazała, że zasadniczo nie było wiązania antagonisty dihydropirydyny swoistej dla VGCC typu L i żadnego immunoreaktywnego białka VGCC typu L na immunoblotach żeli elektroforetycznych poliakryloamidowych. Peletki mikrosomu potraktowane digitoniną zachowały około 10 procent całkowitego związanego ligandu dihydropirydyny znakowanego radioaktywnie. Frakcje wzbogacone o inne białka mięśni szkieletowych, w tym wiążące roninę kanały wiążące rianodynę, ATP-azy wapnia i kaltenestrynę, wytworzono zgodnie z wcześniejszym opisem. 30, 34, 35 ELISA
Antygeny niezawierające detergentu rozcieńczono w 0,1 mola buforu wodorowęglanowego (pH 8,4) na litr do końcowego stężenia do 3 jag białka na mililitr przed dodaniem ich do 96-studzienkowych płytek polistyrenowych ELISA (każda studzienka do mikromiareczkowania zawiera 100 ul; Corning, Corning, NY) do inkubacji przez noc w 4 ° C. Ponieważ obecność detergentów takich jak digitonina i 3 – [(3-cholamidopropylo) dimetyloamonio] -1-propanosulfonian znacznie opóźniła wiązanie antygenów białkowych do plastiku, próbki zawierające detergent inkubowano na płytkach ELISA przez 48 godzin w temperaturze 4 ° C. Gęstość placków dla antygenu VGCC typu L, określona przez wiązanie radioligandu dihydropirydyny, wynosiła zazwyczaj 2 do 4 fmoli (w 0,125 .g białka) na studzienkę do mikromiareczkowania dla częściowo oczyszczonych preparatów i do 20 fmoli (w 0,013 .g białko) na studzienkę do mikromiareczkowania dla wysoce oczyszczonego materiału. Niezwiązany antygen usunięto przez przepłukanie studzienki roztworem 0,9% chlorku sodu i 0,05% Tween 20 (roztwór soli-Tween). Pozostałe miejsca wiążące białka w studzienkach zostały następnie zablokowane przez dodanie 50 mmol buforu TRIS przy pH 7,4 na litr (bufor blokujący, 250 .l na studzienkę), który zawierał procent frakcji V albuminy surowicy bydlęcej (Sigma Chemical, St. Louis), 0,9% chlorku sodu i 0,05% Tween 20, przez 2 godziny w 37 ° C (dla antygenów, które nie były związane detergentem) lub przez 48 godzin w temperaturze 4 ° C (dla próbek zawierających detergent). Posiew immunoreaktywnych VGCC typu L na płytkach ELISA potwierdzono przez dodanie seryjnie rozcieńczonego mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko podjednostce . VGCC podjednostki . do kilku studzienek do mikromiareczkowania w każdej płytce i wizualizowano za pomocą koziej antymubowej sprzężonej z fosfatazą alkaliczną drugiej przeciwciało w rozcieńczeniu 1: 1000 (Promega Biotech, Madison, Wis.). Pomiary niespecyficznego wiązania przeciwciała przeprowadzono przed użyciem testu z płytkami bez antygenu, traktowanymi samym buforem blokującym lub w połączeniu z digitoniną.
Ludzką surowicę lub IgG, które rozcieńczono w buforze blokującym, dodano do studzienek opłaszczonych antygenem przez dwie godziny w 37 ° C. Ludzkie IgG badano w stężeniach w zakresie od 0,05 do 200 .g na mililitr, podczas gdy surowicę dodawano w rozcieńczeniu 1:50 do 1: 156,250. Niezwiązane odczynniki usunięto przez wielokrotne płukanie roztworem soli fizjolo- gicznej i skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą kozią przeciwludzką IgG swoistą dla Fc w rozcieńczeniu 1: 2000 w 100 .l buforu blokującego na studzienkę do mikromiareczkowania (Tago, Burlingame, CA). dodawany do studzienek przez jedną godzinę w 37 ° C
[przypisy: liraglutyd, półpasiec objawy zdjęcia, jak wygląda półpasiec ]