Przeciwciała w surowicy do kanałów wapniowych typu L u pacjentów z stwardnieniem zanikowym bocznym ad

Ponadto ze wszystkich pracowników departamentów i ich rodzin rekrutowano 25 zdrowych osób. Charakterystykę badanych osób przedstawiono w Tabeli 1. Przygotowanie surowicy i immunoglobuliny
Losowo wybrane próbki surowicy zebrano podczas wizyt pacjentów i wizyt w klinikach Baylor College of Medicine-Methodist Hospital w latach 1990-1992. Wykluczono pacjentów z niedawnymi objawami ostrej choroby zakaźnej. Krew pobierano od pacjentów i normalną kontrolę po nocnym poście. Próbki odwirowano przez 10 minut przy 1500 x g i przez 20 minut przy 10000 x g. Supernatanty zmieszano z buforem cytrynianowym sodu (pH 5, stężenie końcowe, 0,1 mol na litr) przez 24 godziny, odwirowano przy 10000 xg przez 30 minut, zrównoważono do pH 7,4 i przechowywano w temperaturze -80 ° C aż do użycia.
Immunoglobuliny oczyszczono z uprzednio nie testowanych próbek surowicy lub osocza traktowanych cytrynianem od pacjentów z połączeniem precypitacji z 45% siarczanem amonu i chromatografią jonowymienną z wysokim natężeniem przepływu (AMF Cuno, Meriden, Conn.) 29 W tej technice , próbki poddano frakcjonowaniu i dializie za pomocą siarczanu amonu i indywidualnie naniesiono na wkłady kationowymienne; związane IgG wymywano następnie przez wkłady anionowymienne, a następnie zatężano przez dializę ciśnieniową (Amicon, Lexington, MA). Czystość próbek IgG wynosiła 90 procent. Niektóre próbki IgG dalej oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na białku A-agaroza, chociaż kontaminacja krzyżowa próbek uzyskanych z tej metody wymagała zastosowania świeżej matrycy powinowactwa dla każdej próbki oczyszczonej IgG.
Całkowite stężenie IgG w surowicy mierzono za pomocą analizatora systemu Technicon RA-1000 (Tarrytown, NY), w którym występuje zmętnienie kompleksu immunologicznego przy 340 nm, zgodnie z testami z surowicowymi standardami surowicy IgG i ludzkiej IgG.
Oczyszczanie antygenów
Ponieważ kompleksy VGCC typu L z mięśni szkieletowych zostały przygotowane w kilku laboratoriach, ostateczny stopień oczyszczenia różnił się. Częściowo oczyszczone kompleksy przygotowano w dwóch laboratoriach. Przed ELISA próbki poddano homogenizacji tkanek, wirowaniu różnicowemu, frakcjonowaniu ciśnieniowemu mikrosomów i frakcjonowaniu z gradientem sacharozy, solubilizacji VGCC typu L z digitoniną, chromatografii powinowactwa do aglutyniny kiełków pszenicy i chromatografii anionowymiennej niskiego ciśnienia .30 Typowe stężenia uzyskane tymi metodami zawierały się w zakresie od 0,02 do 0,04 nmola VGCC L typu L na miligram białka. Bardziej oczyszczone VGCC typu L z mięśni szkieletowych (zawierające 1,7 nmola VGCC typu L na miligram białka) przygotowano w trzecim laboratorium.31 Czystość produktu została określona elektroforetycznie przy użyciu podjednostkowych przeciwciał oznaczonych przeciw L- typ VGCC z mięśni szkieletowych królika.30, 32
Białka cytosolowe z mięśni szkieletowych królika i mikrosomy zubożone VGCC typu L wytworzono przez zebranie nadsączowych frakcji homogenatów mięśni potraktowanych 0,6 mola chlorku potasu na litr i peletki membrany mikrosomalnej wyekstrahowanej 4 procentową digitoniną. 30 Próbki poddano dializie względem 50 mmol buforu TRIS (pH 7,4) na litr, który zawierał 0,1 mola chlorku sodu na litr (dla białek cytozolowych) lub wobec 10 mmol buforu kwasu 3- (N-morfolino) -2-hydroksypropanosulfonowego (pH 7,4) na litr, który zawierał 0,1 mola chlorku sodu na litr i 0,05% Tween 20 detergentu (dla mikrosomów) oraz krótki okres sonikacji (tylko mikrosomy) przed poddaniem ELISA
[podobne: leczenie po amputacji palca, liraglutyd, jak wygląda półpasiec ]