Nawracające somatyczne mutacje DICER1 w nienabłonkowych rakach jajnika AD 4

Chociaż możliwe jest, że mutacja allelu nie będącego gorącym miejscem była obecna w innych nowotworach z tego badania, z powodu ogólnie niskiej jakości DNA z utrwalonych w formalinie próbek zatopionych w parafinie, nie przeprowadzono badań przesiewowych całej sekwencji DICER1. . Funkcjonalna charakterystyka mutantów DICER1
Rysunek 3. Rysunek 3. Charakterystyka funkcjonalna Mutacji DICER1 In Vitro. Testy przeprowadzono na substracie pre-microRNA (miRNA), który jest oparty na ludzkim homologie a-3 Caenorhabditis elegans lethal-7 (Let-7a-3) pre-miRNA i który pozwala na określenie aktywności zarówno w RNase IIIb i Miejsca IIIa. W panelu A substrat pseudo pre-Let7a-3 składa się z dwóch oligonukleotydów z punktem przerwania w normalnej pętli spinki do włosów pre-Let7a-3 (przerywana linia szara). Niebieska linia wskazuje dojrzałe miRNA Let7a-3 uwolnione przez aktywność DICER1, zielona linia pokazuje nicorową gwiazdę miRNA (miRNA *), a czerwone linie oznaczają przewidywane produkty znakowane 5 (*). W panelu B przedstawiono wyniki testu rozszczepienia DICER1. Substraty stanowiły mieszaninę nici 30-nukleotydowej pre-miRNA znakowanej 5 -32P i oligonukleotydy nici 39-nukleotydowej pre-miRNA *. Typy dzikie (wt) D1709, D1709A, D1709E, D1709N i E1705K wskazują oczyszczony metodą powinowactwa DICER1. Kontrole obejmują pusty wektor, reakcję pozorowaną (substraty tylko w buforze testowym enzymu Dicer), handlowy DICER1 typu dzikiego i endogenny DICER1 (oczyszczone immunologicznie z przeciwciałem anty-DICER1). Ścieżka oznaczona jako pre-miRNA / miRNA * pokazuje substraty pre-miRNA i pre-miRNA * jako markery, a ścieżki oznaczone jako drabina pre-miRNA i drabina pre-miRNA * pokazują drabiny hydrolizy tych substratów. Niebieskie i zielone strzałki oznaczają odpowiednio pozycje produktów cięcia domeny RNazy IIIb (około 22 nukleotydów) i RNazy IIIa (około 18 nukleotydów), gdy DICER1 wiąże naturalny substrat pre-Let7a-3 z lewej strony, jak w Panel A. Pełne obrazy żelowe i dodatkowe kontrole przedstawiono na Rysunku 7 w Dodatku Uzupełniającym.
Przeprowadziliśmy testy rozszczepiania RNA w celu porównania aktywności białek DICER1 zawierających substytucje hot-spot D1709N, D1709E i E1705K z próbkami dzikich i kontrolnych, w tym mutanta D1709A o znacznie zmniejszonej aktywności RNazy IIIb, która wykazuje całkowitą utratę Funkcja DICER1 działa tylko wtedy, gdy występuje również podstawienie w domenie RNazy IIIa10,11 (rysunek 3). DICER1 typu dzikiego (w tym formy ektopowe, endogenne i komercyjnie uzyskane) wytworzył produkty o 18 i 22 nukleotydach (figura 3B i fig. 7 w dodatkowym dodatku). Te produkty odpowiadają enzymatycznemu rozszczepieniu, które produkują dojrzały dupleks miRNA (Figura 3A), podczas gdy enzym D1709A wytworzył tylko produkt 18-nukleotydowy, zgodnie z oczekiwaniami. 10,11 To odkrycie wskazuje, że pas 22-nukleotydowy pochodzi z aktywności w miejscu RNazy IIIb, podczas gdy pasmo 18-nukleotydowe jest związane z aktywnością w miejscu RNazy IIIa. Zmutowane w wysokiej temperaturze białka DICER1 dawały wyraźnie niskie poziomy 22-nukleotydowego produktu i istotnych poziomów 18-nukleotydowego produktu, co sugeruje, że, podobnie jak mutacja D1709A, substytucje D1709N, D1709E i E1705K skutkują zmniejszoną aktywnością RNazy IIIb, ale zachowanie aktywności RNazy IIIa.
Wstępna analiza ekspresji miRNA w czterech nowotworach komórek Sertoli-Leydig z mutacjami DICER1 o gorących plamkach miała podobny ogólny poziom dojrzałego lub przetworzonego poziomu ekspresji miRNA, co guza komórek Sertoli-Leydig bez mutacji w DICER1 (Fig. 8 w dodatkowym dodatku). Trzy z tych nowotworów komórek Sertoli-Leydiga miały mutacje drugiego miejsca bez all-hot-spot, z których dwa były znane jako obcięte (Tabela 2). Tak więc, przetwarzanie miRNA w ostatnich dwóch nowotworach komórek Sertoli-Leydig prawdopodobnie zachodzi poprzez mutant DICER1 o gorącym punkcie, w którym to przypadku nowotwory ze zmutowanymi i nieumożliwiającymi mutacjami wersjami DICER1 mają podobne poziomy aktywności przetwarzania miRNA.
Dyskusja
Mutacje DICER1 o gorącym punkcie, które tutaj zgłaszamy, są głównie ograniczone do specyficznego podzbioru nienabłonkowych guzów jajnika i są wysoce rozpowszechnione (60%) w nowotworach komórek Sertoli-Leydig. Obserwowaliśmy także mutacje typu hot-spot w jednym wysokojakościowym jajniakomięsaku jajnika, jednym guzie zarodkowym jądra i dwóch zarodkowych mięśniakomięsaku prążkowanokomórkowym. Obecność tych nawracających mutacji w guzach, które mają pierwotny lub zarodkowy wygląd sugeruje, że ich patogeniczność może być ograniczona do określonych typów komórek lub ustawień rozwojowych.
Generalnie jednak mutacje somatyczne w DICER1 u pacjentów z rakiem są rzadkie. Badanie linii komórkowych raka wykazało, że 4 z 781 miało skrócenie zmian w DICER1.34 Nie jest jasne, czy te mutacje były zarodkowe czy somatyczne, ale wszystkie występowały w liniach niestabilnych mikrosatelit
[więcej w: endometrioza leczenie hormonalne, urolog Wrocław, leczenie żylaków ]
[przypisy: verdin enzymixx, masło kakaowe nierafinowane, pci medycyna ]