Nawracające somatyczne mutacje DICER1 w nienabłonkowych rakach jajnika AD 3

Wśród tych mutacji najbardziej rozpowszechnione były 17 mutacji wpływających na D1709. Potwierdziliśmy, że mutacje były somatyczne w 16 przypadkach, dla których mieliśmy odpowiadające DNA linii płciowej. Próbowaliśmy ocenić wszystkie obszary gorących punktów, przeprowadzając sekwencjonowanie Sangena dwóch niezależnych amplikonów obejmujących reszty wiążące metale (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji Metody w dodatkowym dodatku). Jednak z powodu słabego zachowania DNA w utrwalonym w formalinie materiale zatopionym w parafinie, w niektórych przypadkach mogliśmy sekwencjonować tylko jeden amplikon (4 próbki pozytywne dla mutacji i 18 próbek ujemnych dla mutacji) (Tabela 3 w Dodatku Uzupełniającym). W przypadkach, w których oba regiony amplikonu zostały pomyślnie zsekwencjonowane, mutacje wpływające na jedną resztę wiążącą metal RNase IIIb wzajemnie się wykluczały z mutacjami wpływającymi na dowolną inną resztę wiążącą metal IIIb (P <0,01 według dokładnych testów Fischera) (Fig. 4 w Dodatku Dodatek). Nie zaobserwowaliśmy mutacji wpływających na regiony wiążące metal domeny RNazy IIIa, pomimo ukierunkowanego sekwencjonowania 4 próbek, które były pozytywne dla mutacji RNase IIIb i 9 próbek, które były negatywne pod względem mutacji. Analiza immunohistochemiczna nie dostarczyła informacji o statusie mutacji typu hot-spot , ponieważ wszystkie guzy były dodatnie pod względem ekspresji DICER1 (ryc. 5 w dodatkowym dodatku). Mutacje hot-spot DICER1 nie są obecne w danych projektu 1000 genomów ani w publicznie dostępnych repozytoriach konsorcjum Cancer Genome Atlas. W bazie mutacji Katalogu Mutacji Somatycznych w Raku (COSMIC) nie zgłoszono żadnych powtarzających się mutacji DICER1, w których 4 z 938 nowotworów ma mutacje somatyczne, ale nie ma ich w gorących punktach RNazy IIIb lub równoważnikach RNazy IIIa.32 Ponadto, mutacje te nie były obserwowane w żadnej z ponad 1000 bibliotek z sekwencjonowaniem raka, które badaliśmy lub w 15 dorosłych guzach komórek ziarnistych z mutacjami FOXL2 z naszej kohorty walidacyjnej. Na podstawie zgłoszonej dysfunkcji DICER1 w nabłonkowych rakach jajnika 14 przeanalizowaliśmy dalej serię 266 nabłonkowych raków jajnika i endometrium i zaobserwowaliśmy somatyczną mutację gorącym plamką (c 5676G ? A, kodującą substytucję E1813G) w pojedynczym jajniakowym mięsaku rakowym (Tabela 4 w dodatkowym dodatku).
Związek Mutacje DICER1
Tabela 2. Tabela 2. Pacjenci z mutacją gorącego miejsca i dodatkową mutacją germinalną lub somatyczną DICER1. Rysunek 2. Rysunek 2. Mutacje linii komórkowej DICER1 w Trans z Somatycznymi Mutacjami Hot-Spot. W panelu A próbka od pacjenta z rodzinnym wolem wieloguzkowym i nowotworem komórek Sertoli-Leydiga (SLCT-19) pokazuje zarówno linię zarodkową, jak i somatyczną hot-spotową mutację DICER1. Przedpanele po lewej pokazują ślady sekwencji od linii germinalnej (u góry) i guza (u dołu) w miejscu zarodkowej mutacji DICER1 (5018-5021delTCAA, niebieskie strzałki). Panele boczne po prawej stronie pokazują pozycję gorącej plamki somatycznej mutacji DICER1 (c.5125G ? A, D1709N, czerwona strzałka) z próbek linii zarodkowej (u góry) i guza (u dołu). W panelu B ślad sekwencji ze sklonowanego komplementarnego DNA w próbce SLCT-19 obejmuje zarówno region mutacji linii zarodkowej (5018-5021delTCAA), jak i somatyczną mutację typu hot-spot. Zgodnie z nienotowanym przez matrycę posiewem matrycowym RNA zanotowanym w komórkach limfoblastoidalnych od tego pacjenta zmiana linii płciowej była również niewykrywalna we wszystkich 98 klonowanych produktach RT-PCR z guza, co wskazuje na brak ekspresji tego allelu (patrz również Fig. 6 w Dodatek dodatkowy). Wszystkie nowotwory, w tym SLCT-19, były pozytywne pod względem ekspresji DICER1 w barwieniu immunohistochemicznym (patrz również Fig. 5 w Dodatku Uzupełniającym).
W całej serii naszych odkryć i walidacji siedem próbek miało mutację typu hot-spot i dodatkową linię germinalną lub somatyczną mutację DICER1 (tabela 2 i tabela 3 w dodatkowym dodatku). Aby pokazać, że specyficzna mutacja somatyczna DICER1 o gorącym punkcie była oddzielnym uderzeniem w inny allel od mutacji w linii płciowej, sklonowaliśmy i zsekwencjonowaliśmy komplementarny DNA (cDNA) z próbki SLCT-19, która miała delecję DICER1 linii zarodkowej (5018-5021delTCAA) . Startery do testu odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) zostały wybrane, aby umożliwić wychwytywanie zarówno linii płciowej, jak i zmian somatycznych w pojedynczym amplikonie, jeśli dwie zmiany zachodzą w cis między sobą (Figura 2). Zauważono jedynie allel z mutacją typu hot-spot, a odkrycie zgodne z linią komórkową limfoblastoidalną pochodzącą od tej samej osoby, u której wykazano, że transkrypty zawierające wariant linii płciowej ulegają rozproszeniu w nienaśmieniętym RNA matrycy. Strategia PCR pokazała ponadto, że mutacje w trzech miejscach w gorącym punkcie były w trans z oddzielną mutacją DICER1, a dominowała ekspresja allelu z mutacją w go
[patrz też: kardiolog kielce, nefrolog, trychologia ]
[więcej w: półpasiec objawy zdjęcia, ośrodek psychoterapii warszawa, olx olesno ]