Całkowity niedobór inhibitora plazminogenu typu aktywatora 1 z powodu mutacji z przesunięciem ramki czesc 4

Przewidywany produkt białkowy nie zawiera 169-końcowych aminokwasów PAI-1 typu dzikiego, w tym reaktywnego centrum (Arg346-Met347) .2 Aby zbadać tę mutację u innych członków rodziny, przeprowadzono hybrydyzację swoistą dla oligonukleotydu allelu. (Ryc. 1). Rodzice byli heterozygotyczni pod względem zmutowanej sekwencji, podczas gdy proband był homozygotyczny pod względem nienormalnego allelu. Czworo rodzeństwa było nosicielami mutacji, a dwie były homozygotyczne pod względem normalnej sekwencji. Figura 3. Figura 3. Analiza PCR na mRNA PAI-1. Aby określić wpływ mutacji na mRNA PAI-1 in vivo, mRNA PAI-1 płytki krwi zamplifikowano za pomocą PCR i poddano elektroforezie na żelu agarozowym (górny panel) i hybrydyzacji oligonukleotydowej specyficznej dla allelu (dolne panele). Znaczniki rozmiaru DNA pokazane są po lewej stronie. Jako kontrolę specyficzności swoistych dla allelu sond oligonukleotydowych, analizowano również plazmidowy DNA zawierający zmutowaną sekwencję PAI-1 i produkt PCR RNA pochodzący z płytek krwi zdrowego osobnika (kontrola). Hybrydyzację zmutowanych i sond typu dzikiego do produktów PCR RNA pochodzących od obojga rodziców oznaczono ilościowo za pomocą analizatora Betascope 603 Blot Analyzer (Betagen, Waltham, Mass.), Zgodnie z wcześniej opisaną metodą.24 Te eksperymenty zakładają, że ilości mutanta i DNA typu dzikiego generowane przez RNA PCR są wprost proporcjonalne do ilości zmutowanego i mRNA PAI-1 typu dzikiego obecnego in vivo. Aby kontrolować potencjalne różnice między allelami pod względem wydajności PCR oraz wydajności i specyficzności hybrydyzacji sond, zliczenia allel-specyficzne znormalizowano do tych uzyskanych dla jednocześnie sondowanego produktu PCR wytworzonego z równomolowej mieszaniny PAI z mutantem i typu dzikiego. cDNA. (Strzałka wskazuje proband.)
Badaliśmy wpływ tej mutacji na informacyjny RNA PAI-1 (mRNA) in vivo, przy użyciu płytek krwi wyizolowanych z probandu i jej rodziców. Region flankujący mutację, w tym skrzyżowanie eksonu 4-egzonowego 5, amplifikowano za pomocą PCR (Fig. 3). Produkt PCR mRNA PAI-1 o oczekiwanej wielkości (435 bp) zaobserwowano w próbkach DNA pochodzących od obojga rodziców i normalnej kontroli, a znacznie słabsze prążki wykryto w próbkach z probanda. Hybrydyzacja oligonukleotydu specyficznego dla allelu potwierdziła, że tylko zmutowana sekwencja była obecna w probandzie i że zarówno sekwencje zmutowane, jak i typu dzikiego były obecne u rodziców, sekwencja zmutowana była znacznie mniej obfita. Ilościowa analiza produktów RNA PCR od obojga rodziców wykazała, że zmutowany transkrypt stanowi mniej niż 2 procent całkowitego komórkowego mRNA PAI-1 (Fig. 3). W tych doświadczeniach produkt mRNA normalnego allelu PAI-1 służył jako kontrola wewnętrzna, a mieszanina 50:50 produktów PCR typu dzikiego i zmutowanego RNA byłaby oczekiwana u heterozygot, gdyby odpowiednie gatunki mRNA były przetwarzane podobnie w vivo. Stąd te wyniki sugerują, że zmutowany mRNA PAI-1 jest niestabilny in vivo.
Rysunek 4. Rysunek 4. Charakterystyka zmutowanego białka PAI-1. PAI-1 typu dzikiego i zmutowane ulegały ekspresji w E. coli, a frakcje rozpuszczalne (Sup [supernatant]) i nierozpuszczalne (Pel [wyselekcjonowane]) w lizatach komórek bakteryjnych poddawano elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu i Western blotting
[więcej w: pci medycyna, jak wygląda półpasiec, olx olesno ]